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▪ Revelado con fosfatasa alcalina

1. Lavar la membrana con solución activadora por 10 minutos.

2. Adicionar la solución reveladora y detener la reacción cuando las bandas muestren buena visibilidad. Este procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.

3. Preparar el volumen necesario de solución reveladora. Para prepararla, por cada 10 ml de solución activadora, agregar 33 µl de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y 66 µl de nitro azul de tetrazolio (NBT).

4. Descartar la solución reveladora restante (ver figura 1.5).

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CAPÍTULO 2
TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS TISULARES (TRIPANOSOMIASIS AMERICANA, LEISHMANIASIS, TOXOPLASMOSIS Y MALARIA)
TRIPANOSOMIASIS AMERICANA

La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, el cual es transmitido por insectos hematófagos de la familia Reduviidae. Se estima que en el mundo existen aproximadamente 10 millones de personas infectadas por este parásito y cerca de 25 millones en riesgo de adquirir la infección. Su principal mecanismo de transmisión es la vía vectorial, que predomina en Latinoamérica, seguida de la transmisión oral; sin embargo, es posible detectar la infección en individuos de otras zonas como Estados Unidos, Canadá, Europa y algunos países del Pacífico Oeste, debido a la transmisión por otras vías (transfusional, congénita, posterior a los trasplantes), lo cual se relaciona con las migraciones humanas en zonas en las que no existe el vector (1-3).

Diagnóstico de la tripanosomiasis americana

El diagnóstico de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas se basa en un constructo de pruebas que incluye hallazgos clínicos, antecedentes epidemiológicos y exámenes de laboratorio; estos últimos son, sobre todo, pruebas parasitológicas y serológicas, según la fase de la enfermedad, siendo las pruebas parasitológicas útiles para el diagnóstico de la fase aguda y las serológicas, de la fase latente y crónica (4-6).

Pruebas parasitológicas directas

Las pruebas parasitológicas directas utilizadas son el examen directo de sangre fresca, el extendido de sangre periférica, la gota gruesa y las pruebas de concentración como el método de Strout y microhematocrito.

Examen directo de sangre fresca

Este examen rápido y sencillo permite visualizar al microscopio las formas tripomastigotas del parásito en movimiento en una gota de sangre entre lámina y laminilla.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: lanceta estéril, gasa estéril, portaobjetos, cubreobjetos y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1).

Procedimiento

1. Limpiar muy bien la zona de la que se va a extraer la sangre; por lo general, esta es el pulpejo del dedo de la mano. En caso de niños, también se puede tomar la muestra del dedo del pie o del lóbulo de la oreja.

2. Tomar una gota de sangre por punción con una lanceta estéril y descartar la primera gota de sangre.

3. Colocar la gota de sangre sobre un portaobjetos, agregar una gota de solución salina al 0.85 % y mezclar.

4. Colocar una laminilla y observar al microscopio con el objetivo de 40X.

El examen debe ser minucioso y se debe observar toda la muestra. Se puede hacer este mismo procedimiento con muestras de líquido pericárdico o líquido cefalorraquídeo (LCR). El examen se considera positivo al visualizar las formas tripomastigotas del parásito, generalmente en movimiento serpenteante entre los glóbulos rojos y los leucocitos. Si el examen es negativo, y ante la persistencia de sospecha clínica, debe realizarse un estudio seriado de nuevas muestras de sangre durante varios días.

Extendido de sangre periférica y gota gruesa

Para la realización tanto del extendido de sangre periférica como de la gota gruesa, se requiere una muestra de sangre capilar en un portaobjetos que será coloreada con una tinción derivada de Romanowsky (Wright, Field, Giemsa), previa a fijación con metanol.

Procedimiento para la toma de muestra

1. Tomar una muestra de sangre con una lanceta estéril en el pulpejo de algún dedo de la mano (o del pie, o del lóbulo de la oreja en el caso de los niños), previa asepsia y antisepsia de la zona. Descartar la primera gota de sangre.

2. Colocar una gota de sangre en el extremo de un portaobjeto para el extendido y dos o tres gotas a lo largo de otro portaobjetos para realizar la gota gruesa.

3. Para el extendido, es necesario esparcir la gota a lo largo del portaobjetos con ayuda del borde de otro portaobjetos en un ángulo de 30 ° o 40 °. Para las gotas gruesas, es necesario extender cada una de las gotas de sangre y formar un pequeño rectángulo, con ayuda de la esquina de un segundo portaobjetos, como se puede ver en la figura 2.1.

4. Dejar secar muy bien las láminas en un lugar libre de polvo antes de realizar la coloración.

Figura 2.1. Procedimiento para la realización del extendido de sangre periférica y la gota gruesa.

Fuente: elaboración propia.

El extendido de sangre periférica es una técnica poco sensible; sin embargo, se observa la morfología característica del parásito y se pueden identificar con claridad cinetoplasto, núcleo, flagelo y membrana ondulante.

Coloración para el extendido y gota gruesa

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: metanol, portaobjetos curvo para coloración, solución colorante de Giemsa (ver anexo 64), solución de agua amortiguada (ver anexo 65) y coloración de Wright (ver anexo 66).

Procedimiento para el extendido

1. Fijar el extendido de sangre periférica con unas gotas de metanol puro durante algunos segundos y dejar secar.

2. Mezclar dos gotas de solución colorante de Giemsa por cada mililitro de agua amortiguada.

3. Colocar la solución colorante antes preparada sobre el extendido fijado o proceder igual que en la gota gruesa.

4. Colorear a temperatura ambiente durante 20 minutos. Este tiempo puede variar según el lote de colorante empleado.

5. Lavar cuidadosamente con agua corriente (chorro suave).

6. Dejar secar y observar al microscopio de luz con el objetivo de inmersión 100X.

Las muestras también pueden ser teñidas con la coloración de Wright.

Procedimiento para la gota gruesa

Esta técnica, también utilizada para el diagnóstico de malaria, brinda la posibilidad de concentrar varias capas de sangre (de 20 a 30 en relación con el extendido). Por lo tanto, es más sensible que el examen en fresco y que el extendido de sangre periférica.

1. Mezclar una gota de solución colorante de Giemsa por cada mililitro de agua amortiguada.

2. Invertir la lámina sobre la solución colorante en un portaobjetos curvo para coloración, con el fin de permitir su deshemoglobinización y evitar la formación de burbujas (ver figura 2.1).

3. Colorear a temperatura ambiente durante 10 minutos. Este tiempo puede variar según el lote de colorante empleado.

4. Lavar cuidadosamente con agua corriente (chorro suave) por el reverso del portaobjetos.

5. Dejar secar y observar al microscopio de luz con objetivo de inmersión 100X.

Las muestras también pueden ser teñidas con la coloración de Wright.

Microhematocrito

Esta es una técnica de concentración de alta sensibilidad durante la fase aguda y se utiliza ampliamente en casos de tripanosomiasis congénita, porque requiere poca cantidad de sangre.

Procedimiento

1. Tomar una muestra de sangre en un capilar de microhematocrito con anticoagulante.

2. Centrifugar a 800 g y romper el capilar a nivel de la interfase leucoplaquetaria, es decir, entre los glóbulos rojos y glóbulos blancos.

3. Verter su contenido en un portaobjetos, cubrir con una laminilla y observar en un montaje directo o en fresco.

4. También es posible realizar un extendido y teñir con solución colorante o con la coloración de Wright, como se explicó en los apartes que se refieren al procedimiento para el extendido y la gota gruesa. Se deben buscar formas tripomastigotes en movimiento o coloreadas en la muestra en el portaobjetos.

Método de Strout

Este método es una de las técnicas más sensibles, con 90 % a 100 % de sensibilidad en fase aguda y 10 % en fase crónica, pero requiere de un volumen mayor de sangre (5-8).

Procedimiento

1. Tomar 10 ml de sangre por punción venosa en un tubo seco, dejando que el coágulo se forme y se retraiga.

2. Centrifugar a 800 g para eliminar los glóbulos rojos restantes.

3. Centrifugar a 500 g para concentrar los parásitos en el sedimento.

4. Hacer un montaje en fresco o teñir con solución colorante o coloración de Wright a partir de este sedimento, con el fin de observar las formas tripomastigotes.

Biopsia

La biopsia permite identificar los nidos de amastigotes del parásito en los tejidos (9).

Procedimiento

1. Realizar cortes histológicos y colorear con hematoxilina-eosina (10).

2. Observar los nidos de amastigotes de T. cruzi en tejidos como fibra cardiaca, ganglio linfático y cerebro.

Es posible, además, realizar una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) a partir de estas muestras para confirmar la presencia del parásito, a pesar de que no existan formas circulantes.